选修1知识点总结
微生物实验室培养
基础知识
1 培养基：微生物营养物质需求配制出供生长繁殖营养基质进行微生物培养物质基础
（1）培养基分类：
·培养基物理性质分液体培养基半固体培养基固体培养基
液体培养基中加入凝固剂琼脂（红藻中提取种糖配制培养基中作凝固剂）制成琼脂固体培养基
微生物固体培养基表面生长形成肉眼见菌落根菌落特征判断种菌
液体培养基应工业生活生产固体培养基应微生物分离鉴定半固体培养基常观察微生物运动菌种保藏等
·成分培养基分工合成培养基天然培养基
合成培养基成分已知化学物质配制成中成分种类例明确常微生物分离鉴定
天然培养基化学成分明天然物质配制成常实际工业生产
·培养基途培养基分选择培养基鉴定培养基
选择培养基指培养基中加入某种化学物质抑制需微生物生长促进需微生物生长
鉴培养基根微生物特点培养基中加入某种指示剂化学药品配制成鉴类微生物
（2）培养基成分：培养基化学成分包括水机盐碳源氮源生长子等
·碳源：微生物代谢提供碳元素物质CO2NaHCO3等机碳源糖类石油花生粉饼等机碳源异养微生物利机碳源单质碳作碳源
·氮源：微生物代谢提供氮元素物质N2NH3NO3NH4+（机氮源）蛋白质氨基酸尿素牛肉膏蛋白胨（机氮源）等固氮微生物利N2
·培养基满足微生物生长PH特殊营养物质氧气求
例培养乳酸杆菌时需培养基中添加维生素培养霉菌时须培养基pH调酸性培养细菌需pH调中性微碱性培养厌氧型微生物需提供氧条件
2 菌技术
a 获纯净培养物关键防止外杂菌入侵注意方面：
① 实验操作空间操作者衣着手进行清洁消毒
② 微生物培养器皿接种具培养基等器具进行灭菌
③ 避免周围环境中微生物污染实验操作应酒精灯火焰附进行
④ 实验操作时应避免已灭菌处理材料具周围物品相接触
b 菌技术防止实验室培养物外微生物污染外什目？
答：菌技术效避免操作者身微生物感染
c 消毒灭菌区
① 消毒指较温物理化学方法仅杀死物体表面部部分体害微生物（包括芽孢孢子）消毒方法常煮沸消毒法巴氏消毒法（耐高温液体）化学药剂（酒精氯气石炭酸等）消毒紫外线消毒
② 灭菌指强烈理化素杀死物体外微生物包括芽孢孢子灭菌方法灼烧灭菌干热灭菌高压蒸汽灭菌
d． 常器具灭菌方法：
① 接种环接种针试口等灼烧灭菌法
② 玻璃器皿金属具等干热灭菌法器械干热灭菌箱
③ 培养基菌水等高压蒸汽灭菌法器械高压蒸汽灭菌锅
④ 表面灭菌空气灭菌等紫外线灭菌法器械紫外灯
较项
理化素作强度
消灭微生物数量
芽孢孢子否消灭
消毒
较温
部分生活状态微生物
灭菌
强烈
全部微生物
3．实验操作
（1）制作牛肉膏蛋白胨固体培养基
① 方法步骤：计算称量溶化灭菌倒板
② 倒板操作：
a 灭菌培养皿放火焰旁桌面右手装培养基锥形瓶左手拔出棉塞
b 右手锥形瓶瓶口迅速通火焰
c 左手拇指食指培养皿开条稍瓶口缝隙右手锥形瓶中培养基（约10～20mL）倒入培养皿左手立盖培养皿皿盖
d 等板冷凝固约需5～10min然板倒放置培养皿盖皿底
·倒板操作讨
① 培养基灭菌需冷50℃左右时倒板什办法估计培养基温度？
提示：手触摸盛培养基锥形瓶感觉锥形瓶温度降刚刚烫手时进行倒板
② 什需锥形瓶瓶口通火焰？
答：通灼烧灭菌防止瓶口微生物污染培养基
③ 板冷凝什板倒置？
答：板冷凝皿盖会凝结水珠凝固培养基表面湿度较高板倒置培养基表面水分更挥发防止皿盖水珠落入培养基造成污染
④ 倒板程中果心培养基溅皿盖皿底间部位板培养微生物？什？
答：空气中微生物皿盖皿底间培养基滋生板培养微生物
（2）纯化肠杆菌
① 微生物接种方法常板划线法稀释涂布板法
② 板划线法通接种环琼脂固体培养基表面连续划线操作聚集菌种逐步稀释分散培养基表面数次划线培养分离细胞繁殖肉眼见子细胞群体菌落
③ 稀释涂布板法菌液进行系列梯度稀释然稀释度菌液分涂布琼脂固体培养基表面进行培养分系列稀释操作涂布板操作两步
④ 板划线法稀释涂布板法接种目：聚集起微生物分散成单细胞培养基表面形成单菌落便纯化菌种
（3）板划线法操作步骤：
①接种环放火焰灼烧直接种环烧红
②火焰旁冷接种环开棉塞
③试口通火焰
④已冷接种环伸入菌液中蘸取环菌液
⑤试通火焰塞棉塞
⑥左手皿盖开条缝隙右手沾菌种接种环迅速伸入板划三五条行线盖皿盖注意划破培养皿
⑦灼烧接种环冷第区域划线末端开始第二区域划线重复操作三四五区域划线注意区划线第区相连
⑧板倒置放入培养箱中培养
·板划线操作讨
1什操作第步次划线前灼烧接种环？划线操作结束时然需灼烧接种环？什？
答：操作第步灼烧接种环避免接种环存微生物污染培养物次划线前灼烧接种环杀死次划线结束接种环残留菌种次划线时接种环菌种直接源次划线末端通划线次数增加次划线时菌种数目逐渐减少便菌落划线结束灼烧接种环时杀死接种环残留菌种避免细菌污染环境感染操作者
2灼烧接种环什等冷进行划线？
答：免接种环温度太高杀死菌种
3作第二次划线操作时什总次划线末端开始划线？
答：划线线条末端细菌数目线条起始处少次次划线末端开始细菌数目着划线次数增加逐步减少终单细菌繁殖菌落
（4）涂布板操作步骤：
①涂布器浸盛酒精烧杯中
②取少量菌液滴加培养基表面
③沾少量酒精涂布器火焰引燃酒精燃冷8～10s
④涂布器菌液均匀涂布培养基表面
·涂布板操作讨
1 涂布板操作应火焰附进行结合板划线系列稀释菌操作求想想第二步应进行菌操作？
提示：应操作细节保证菌例酒精灯培养皿距离合适吸头接触物体吸酒精灯火焰周围等等
（4）菌种保存
（1）频繁菌种采时保藏方法
①时保藏方法
菌种接种试固体斜面培养基合适温度培养菌落长成试放入4℃冰箱中保藏3～6月重新菌种旧培养基转移新鲜培养基
②缺点：种方法保存时间长菌种容易污染产生变异
（2）需长期保存菌种采甘油藏方法
3mL甘油瓶中装入1mL甘油灭菌1mL培养菌液转移甘油瓶中甘油充分混匀放－20℃冷冻箱中保存
（5）疑难解答
① 生物营养
营养指生物摄取利营养物质程营养物质指维持机体生命活动保证发育生殖需外源物质
动物营养物质：水机盐糖类脂质蛋白质维生素六类
植物营养物质：矿质元素水二氧化碳等三类
微生物营养物质：水机盐碳源氮源特殊营养物质五类
② 确定培养基制作否合格方法
未接种培养基恒温箱中保温1～2天菌落生长说明培养基制备成功否需重新制备
土壤中分解尿素细菌分离计数
尿素：种重农业氮肥尿素直接农作物吸收土壤中细菌尿素分解成氨植物利土壤中细菌分解尿素合成脲酶尿素初尿液中发现
筛选菌株：
（1）实验室中微生物筛选应原理：
提供利目菌株生长条件（包括营养温度pH等）时抑制阻止微生物生长
（2）选择性培养基
微生物学中允许特定种类微生物生长时抑制阻止种类微生物生长培养基称作选择培养基
（3）配制选择培养基
根选择培养菌种生理代谢特点加入某种物质达选择目例培养基中加入机物选择培养养微生物培养基中加入氮元素选择培养固氮微生物加入高浓度食盐选择培养金黄色葡萄球菌等
二统计菌落数目
（1）测定微生物数量常方法稀释涂布板法显微镜直接计数
（2）稀释涂布板法统计样品中活菌数目原理
样品稀释度足够高时培养基表面生长菌落源样品稀释液中活菌通统计板菌落数推测出样品中约含少活细菌保证结果准确般设置3～5板选择菌落数30～300板进行计数取均值统计菌落数活菌实际数目低统计结果般菌落数活菌数表示
三设置
设置目排实验组中非测试素实验结果影响提高实验结果信度实验指测试条件外条件相实验作试验组排原干扰证明确实测试条件引起相应结果
四实验设计
实验设计包括实验方案需仪器材料具药品具体实施步骤时间安排等综合考虑安排
（1）土壤取样：生物环境相土壤中微生物数量种类富含机质土壤表层更微生物生长富含机物潮湿pH≈7土壤中取样铲表层土距表约3～8cm土壤层取样
（2）样品稀释：样品稀释程度直接影响板生长菌落数目实际操作中通常选定稀释范围样品液进行培养保证获菌落数30~300间适计数板
测定土壤中细菌数量般选104105106
测定放线菌数量般选103104105
测定真菌数量般选102103104
（3）微生物培养观察
种类微生物需培养温度培养时间
细菌30～37℃ 1～2天
放线菌25～28℃ 5～7天
霉菌25～28℃ 3～4天
隔24时统计次菌落数目选取菌落数目稳定时记录作结果样防止培养时间足导致楼菌落数目般说定培养条件（相培养基唯独培养时间）种微生物表现出稳定菌落特征形状隆起程度颜色
五疑难解答
（1）板菌落数推测出克样品中菌落数？
统计某稀释度板菌落数统计3板计算出板菌落数均值
克样品中菌落数（CV）*M
中C代表某稀释度板生长均菌落数V代表涂布板时稀释液体积（ml）M代表稀释倍数
分解纤维素微生物分离
纤维素纤维素酶
纤维素：种葡萄糖首尾相连成高分子化合物球含量丰富糖类物质
（1）棉花然界中纤维素含量高天然产物木材作物秸秆等富含纤维素
（2）纤维素酶种复合酶般认少包括三种组分C1酶CX酶葡萄糖苷酶前两种酶纤维素分解成纤维二糖第三种酶纤维二糖分解成葡萄糖纤维素终水解成葡萄糖微生物生长提供营养
二纤维素分解菌筛选
（1）筛选方法：刚果红染色法够通颜色反应直接微生物进行筛选
（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌原理
刚果红种染料纤维素样糖物质形成红色复合物水解纤维二糖葡萄糖发生种反应含纤维素培养基中加入刚果红时刚果红培养基中纤维素形成红色复合物纤维素纤维素酶分解刚果红－纤维素复合物法形成培养基中会出现纤维素分解菌中心透明圈样通否产生透明圈筛选纤维素分解菌
三分离分解纤维素微生物实验流程
土壤取样→选择培养（步否需应根样品中目菌株数量少确定）→梯度稀释→样品涂布鉴纤维素分解菌培养基→挑选产生透明圈菌落
（1）土壤采集：选择富含纤维素环境
（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌步骤：倒板操作制备菌悬液涂布板
（3）刚果红染色法种类：
种先培养微生物加入刚果红进行颜色反应种倒板时加入刚果红
四课题延伸
分解纤维素微生物进行初步筛选分离纯化第步确定纤维素分解菌需进行发酵产纤维素酶实验纤维素酶发酵方法液体发酵固体发酵两种纤维素酶测定方法般纤维素酶分解滤纸等纤维素产生葡萄糖进行定量测定
五疑难解答
（1）什富含纤维素环境中寻找纤维素分解菌？
生物环境相互存关系富含纤维素环境中纤维素分解菌含量相提高种土样中获目微生物率高普通环境
（2）滤纸埋土壤中什作？认滤纸应该埋进土壤深？
滤纸埋土壤中纤维素分解菌相聚集实际工设置纤维素分解菌生存适宜环境般应纸埋深约10cm左右腐殖土壤中
（3）两种刚果红染色法较
方法传统方法缺点操作繁琐加入刚果红溶液会菌落间发生混杂优点样显示出颜色反应基纤维素分解菌作
方法二优点操作简便存菌落混杂问题缺点纤维素琼脂土豆汁中含淀粉类物质够产生淀粉酶微生物出现假阳性反应种产生淀粉酶微生物产生透明圈较模糊培养基中纤维素占位纤维素酶产生透明圈相区分方法二缺点：微生物具降解色素力长时间培养程中会降解刚果红形成明显透明圈纤维素分解菌易区分
（4）什选择培养够浓缩需微生物？
选择培养条件够适应种营养条件微生物迅速繁殖适应种营养条件微生物繁殖抑制起浓缩作
果酒果醋制作
实验原理
酶
1．酒精发酵原理：
酶
① 酵母菌进行氧呼吸量繁殖表达式：C6H12O6+O2→CO2+H2O+量
② 酵母菌进行氧呼吸产生酒精二氧化碳表达式：C6H12O6→C2H5OH+CO2+量
③ 酵母菌营养代谢类型异养兼性厌氧型氧时酵母菌量繁殖起发酵效果氧时繁殖速度减慢时进行发酵利酵母菌发酵时先通入足够菌空气氧环境段时间繁殖隔绝氧气进行发酵20℃左右适合酵母菌繁殖酒精发酵佳温度18℃～25℃pH弱酸性
酶
2．醋酸发酵原理：
① 醋酸菌氧型细菌缺少糖源时氧条件乙醇（酒精）氧化成醋酸
表达式：C2H5OH+O2→CH3COOH+H2O
氧气糖源充足时醋酸菌葡萄汁中糖分解成醋酸
醋酸菌生长佳温度30℃～35℃
二实验步骤
1 发酵瓶纱布榨汁机盛葡萄汁器皿等实验具进行清洗消毒先温水反复洗次体积分数75酒精擦拭消毒晾干
2 取葡萄500 g枝梗腐烂子粒
3 清水洗葡萄1～2遍污物注意反复次洗
4 榨汁机榨取葡萄汁装入发酵瓶中葡萄成浆洁净纱布滤发酵瓶中盖瓶盖果没合适发酵装置500 mL塑料瓶代注入果汁量超塑料瓶总体积23
5 发酵瓶置适宜温度发酵
6 发酵旺盛期CO2产量非常需时排气防止发酵瓶爆裂果简易发酵装置瓶子（选塑料瓶）天拧松瓶盖2～4次进行排气
7 10 d开始进行取样检验工作例检验酒味酒精含量进行酵母菌镜检等工作
8 果酒制成发酵液中加入醋酸菌醋曲然装置转移30～35 ℃条件发酵适时发酵液中充气果找醋酸菌菌种醋曲尝试然接种效果果没充气装置瓶盖开瓶口盖纱布减少空气中尘土等污染
三注意事项
请分析装置中充气口排气口出料口分作什排气口通长弯曲胶瓶身连接？结合果酒果醋制作原理认应该发酵装置？
充气口 排气口
出料口
答：充气口醋酸发酵时连接充气泵进行充气排气口酒精发酵时排出CO2出料口取样排气口通长弯曲胶瓶身连接目防止空气中微生物污染该装置制酒时应该关闭充气口制醋时应充气口连接气泵输入氧气
腐乳制作
实验原理
1．参豆腐发酵微生物青霉酵母曲霉毛霉等种中起作毛霉
2．毛霉种丝状真菌营养代谢类型异养需氧型适生长温度1518℃常见土壤水果蔬菜谷物具发达白色菌丝
3毛酶等微生物产生蛋白酶豆腐中蛋白质分解成分子肽氨基酸脂肪酶脂肪分解成甘油脂肪酸
二实验步骤
1豆腐切成3cm×3cm×1cm干块豆腐含水量70％左右水分腐乳易成形
2豆腐块放铺干粽叶盘粽叶提供菌种起保温作块豆腐等距离排放周围留定空隙豆腐面铺干净粽叶气候干燥时盘保鲜膜包裹封严免湿度太高利毛霉生长
3盘放入温度保持15～18 ℃方毛霉逐渐生长约5 d豆腐表面丛生着直立菌丝
4毛霉生长旺盛呈淡黄色时包裹盘保鲜膜铺面粽叶豆腐块热量水分够迅速散失时散霉味程般持续36 h
5豆腐凉透豆腐间连接起菌丝拉断整齐排列容器准备腌制
6长满毛霉豆腐块（称毛坯）盐质量分数5∶1培养毛坯时盘没长直立菌丝面统玻璃瓶边毛坯分层盘立摆放容器中分层加盐层加高增加盐量瓶口表面铺盐厚防止杂菌瓶口进入约腌制8 d
〔注：加盐析出豆腐中水分利腐乳成型盐够抑制微生物生长调味盐腌制时注意盐量盐浓度低足抑制微生物生长导致豆腐腐败变质盐浓度高会影响腐乳口味〕
7黄酒米酒糖口味配种香辛料（胡椒花椒八角茴香桂皮姜辣椒等）混合制成卤汤卤汤酒精含量控制12％左右宜
〔注：酒精含量高低腐乳期发酵时间长短关系酒精含量越高蛋白酶抑制作越腐乳成熟期延长酒精含量低蛋白酶活性高加快蛋白质水解杂菌繁殖快豆腐易腐败难成块〕
8广口玻璃瓶刷干净高压锅100 ℃蒸汽灭菌30 min腐乳咸坯摆入瓶中加入卤汤辅料瓶口酒精灯加热灭菌胶条密封常温情况般六月成熟
三注意事项
1酿造腐乳生产工序豆腐进行前期发酵期发酵前期发酵发生变化毛霉豆腐（白坯）生长发酵温度15～18 ℃温度适细菌酵母菌曲霉生长适毛霉慢慢生长毛霉生长约5 d白坯变成毛坯前期发酵作豆腐表面层菌膜包住形成腐乳体二毛霉分泌蛋白酶种酶利豆腐含蛋白质水解种氨基酸期发酵酶微生物协参生化反应程通腌制配入种辅料（红曲面曲酒酿）蛋白酶作缓慢促进生化反应生成腐乳香气
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微生物实验室培养
基础知识
1 培养基：微生物营养物质需求配制出供生长繁殖营养基质进行微生物培养物质基础
（1）培养基分类：
·培养基物理性质分液体培养基半固体培养基固体培养基
液体培养基中加入凝固剂琼脂（红藻中提取种糖配制培养基中作凝固剂）制成琼脂固体培养基
微生物固体培养基表面生长形成肉眼见菌落根菌落特征判断种菌
液体培养基应工业生活生产固体培养基应微生物分离鉴定半固体培养基常观察微生物运动菌种保藏等
·成分培养基分工合成培养基天然培养基
合成培养基成分已知化学物质配制成中成分种类例明确常微生物分离鉴定
天然培养基化学成分明天然物质配制成常实际工业生产
·培养基途培养基分选择培养基鉴定培养基
选择培养基指培养基中加入某种化学物质抑制需微生物生长促进需微生物生长
鉴培养基根微生物特点培养基中加入某种指示剂化学药品配制成鉴类微生物
（2）培养基成分：培养基化学成分包括水机盐碳源氮源生长子等
·碳源：微生物代谢提供碳元素物质CO2NaHCO3等机碳源糖类石油花生粉饼等机碳源异养微生物利机碳源单质碳作碳源
·氮源：微生物代谢提供氮元素物质N2NH3NO3NH4+（机氮源）蛋白质氨基酸尿素牛肉膏蛋白胨（机氮源）等固氮微生物利N2
·培养基满足微生物生长PH特殊营养物质氧气求
例培养乳酸杆菌时需培养基中添加维生素培养霉菌时须培养基pH调酸性培养细菌需pH调中性微碱性培养厌氧型微生物需提供氧条件
2 菌技术
a 获纯净培养物关键防止外杂菌入侵注意方面：
① 实验操作空间操作者衣着手进行清洁消毒
② 微生物培养器皿接种具培养基等器具进行灭菌
③ 避免周围环境中微生物污染实验操作应酒精灯火焰附进行
④ 实验操作时应避免已灭菌处理材料具周围物品相接触
b 菌技术防止实验室培养物外微生物污染外什目？
答：菌技术效避免操作者身微生物感染
c 消毒灭菌区
① 消毒指较温物理化学方法仅杀死物体表面部部分体害微生物（包括芽孢孢子）消毒方法常煮沸消毒法巴氏消毒法（耐高温液体）化学药剂（酒精氯气石炭酸等）消毒紫外线消毒
② 灭菌指强烈理化素杀死物体外微生物包括芽孢孢子灭菌方法灼烧灭菌干热灭菌高压蒸汽灭菌
d． 常器具灭菌方法：
① 接种环接种针试口等灼烧灭菌法
② 玻璃器皿金属具等干热灭菌法器械干热灭菌箱
③ 培养基菌水等高压蒸汽灭菌法器械高压蒸汽灭菌锅
④ 表面灭菌空气灭菌等紫外线灭菌法器械紫外灯
较项
理化素作强度
消灭微生物数量
芽孢孢子否消灭
消毒
较温
部分生活状态微生物
灭菌
强烈
全部微生物
3．实验操作
（1）制作牛肉膏蛋白胨固体培养基
① 方法步骤：计算称量溶化灭菌倒板
② 倒板操作：
a 灭菌培养皿放火焰旁桌面右手装培养基锥形瓶左手拔出棉塞
b 右手锥形瓶瓶口迅速通火焰
c 左手拇指食指培养皿开条稍瓶口缝隙右手锥形瓶中培养基（约10～20mL）倒入培养皿左手立盖培养皿皿盖
d 等板冷凝固约需5～10min然板倒放置培养皿盖皿底
·倒板操作讨
① 培养基灭菌需冷50℃左右时倒板什办法估计培养基温度？
提示：手触摸盛培养基锥形瓶感觉锥形瓶温度降刚刚烫手时进行倒板
② 什需锥形瓶瓶口通火焰？
答：通灼烧灭菌防止瓶口微生物污染培养基
③ 板冷凝什板倒置？
答：板冷凝皿盖会凝结水珠凝固培养基表面湿度较高板倒置培养基表面水分更挥发防止皿盖水珠落入培养基造成污染
④ 倒板程中果心培养基溅皿盖皿底间部位板培养微生物？什？
答：空气中微生物皿盖皿底间培养基滋生板培养微生物
（2）纯化肠杆菌
① 微生物接种方法常板划线法稀释涂布板法
② 板划线法通接种环琼脂固体培养基表面连续划线操作聚集菌种逐步稀释分散培养基表面数次划线培养分离细胞繁殖肉眼见子细胞群体菌落
③ 稀释涂布板法菌液进行系列梯度稀释然稀释度菌液分涂布琼脂固体培养基表面进行培养分系列稀释操作涂布板操作两步
④ 板划线法稀释涂布板法接种目：聚集起微生物分散成单细胞培养基表面形成单菌落便纯化菌种
（3）板划线法操作步骤：
①接种环放火焰灼烧直接种环烧红
②火焰旁冷接种环开棉塞
③试口通火焰
④已冷接种环伸入菌液中蘸取环菌液
⑤试通火焰塞棉塞
⑥左手皿盖开条缝隙右手沾菌种接种环迅速伸入板划三五条行线盖皿盖注意划破培养皿
⑦灼烧接种环冷第区域划线末端开始第二区域划线重复操作三四五区域划线注意区划线第区相连
⑧板倒置放入培养箱中培养
·板划线操作讨
1什操作第步次划线前灼烧接种环？划线操作结束时然需灼烧接种环？什？
答：操作第步灼烧接种环避免接种环存微生物污染培养物次划线前灼烧接种环杀死次划线结束接种环残留菌种次划线时接种环菌种直接源次划线末端通划线次数增加次划线时菌种数目逐渐减少便菌落划线结束灼烧接种环时杀死接种环残留菌种避免细菌污染环境感染操作者
2灼烧接种环什等冷进行划线？
答：免接种环温度太高杀死菌种
3作第二次划线操作时什总次划线末端开始划线？
答：划线线条末端细菌数目线条起始处少次次划线末端开始细菌数目着划线次数增加逐步减少终单细菌繁殖菌落
（4）涂布板操作步骤：
①涂布器浸盛酒精烧杯中
②取少量菌液滴加培养基表面
③沾少量酒精涂布器火焰引燃酒精燃冷8～10s
④涂布器菌液均匀涂布培养基表面
·涂布板操作讨
1 涂布板操作应火焰附进行结合板划线系列稀释菌操作求想想第二步应进行菌操作？
提示：应操作细节保证菌例酒精灯培养皿距离合适吸头接触物体吸酒精灯火焰周围等等
（4）菌种保存
（1）频繁菌种采时保藏方法
①时保藏方法
菌种接种试固体斜面培养基合适温度培养菌落长成试放入4℃冰箱中保藏3～6月重新菌种旧培养基转移新鲜培养基
②缺点：种方法保存时间长菌种容易污染产生变异
（2）需长期保存菌种采甘油藏方法
3mL甘油瓶中装入1mL甘油灭菌1mL培养菌液转移甘油瓶中甘油充分混匀放－20℃冷冻箱中保存
（5）疑难解答
① 生物营养
营养指生物摄取利营养物质程营养物质指维持机体生命活动保证发育生殖需外源物质
动物营养物质：水机盐糖类脂质蛋白质维生素六类
植物营养物质：矿质元素水二氧化碳等三类
微生物营养物质：水机盐碳源氮源特殊营养物质五类
② 确定培养基制作否合格方法
未接种培养基恒温箱中保温1～2天菌落生长说明培养基制备成功否需重新制备
土壤中分解尿素细菌分离计数
尿素：种重农业氮肥尿素直接农作物吸收土壤中细菌尿素分解成氨植物利土壤中细菌分解尿素合成脲酶尿素初尿液中发现
筛选菌株：
（1）实验室中微生物筛选应原理：
提供利目菌株生长条件（包括营养温度pH等）时抑制阻止微生物生长
（2）选择性培养基
微生物学中允许特定种类微生物生长时抑制阻止种类微生物生长培养基称作选择培养基
（3）配制选择培养基
根选择培养菌种生理代谢特点加入某种物质达选择目例培养基中加入机物选择培养养微生物培养基中加入氮元素选择培养固氮微生物加入高浓度食盐选择培养金黄色葡萄球菌等
二统计菌落数目
（1）测定微生物数量常方法稀释涂布板法显微镜直接计数
（2）稀释涂布板法统计样品中活菌数目原理
样品稀释度足够高时培养基表面生长菌落源样品稀释液中活菌通统计板菌落数推测出样品中约含少活细菌保证结果准确般设置3～5板选择菌落数30～300板进行计数取均值统计菌落数活菌实际数目低统计结果般菌落数活菌数表示
三设置
设置目排实验组中非测试素实验结果影响提高实验结果信度实验指测试条件外条件相实验作试验组排原干扰证明确实测试条件引起相应结果
四实验设计
实验设计包括实验方案需仪器材料具药品具体实施步骤时间安排等综合考虑安排
（1）土壤取样：生物环境相土壤中微生物数量种类富含机质土壤表层更微生物生长富含机物潮湿pH≈7土壤中取样铲表层土距表约3～8cm土壤层取样
（2）样品稀释：样品稀释程度直接影响板生长菌落数目实际操作中通常选定稀释范围样品液进行培养保证获菌落数30~300间适计数板
测定土壤中细菌数量般选104105106
测定放线菌数量般选103104105
测定真菌数量般选102103104
（3）微生物培养观察
种类微生物需培养温度培养时间
细菌30～37℃ 1～2天
放线菌25～28℃ 5～7天
霉菌25～28℃ 3～4天
隔24时统计次菌落数目选取菌落数目稳定时记录作结果样防止培养时间足导致楼菌落数目般说定培养条件（相培养基唯独培养时间）种微生物表现出稳定菌落特征形状隆起程度颜色
五疑难解答
（1）板菌落数推测出克样品中菌落数？
统计某稀释度板菌落数统计3板计算出板菌落数均值
克样品中菌落数（CV）*M
中C代表某稀释度板生长均菌落数V代表涂布板时稀释液体积（ml）M代表稀释倍数
分解纤维素微生物分离
纤维素纤维素酶
纤维素：种葡萄糖首尾相连成高分子化合物球含量丰富糖类物质
（1）棉花然界中纤维素含量高天然产物木材作物秸秆等富含纤维素
（2）纤维素酶种复合酶般认少包括三种组分C1酶CX酶葡萄糖苷酶前两种酶纤维素分解成纤维二糖第三种酶纤维二糖分解成葡萄糖纤维素终水解成葡萄糖微生物生长提供营养
二纤维素分解菌筛选
（1）筛选方法：刚果红染色法够通颜色反应直接微生物进行筛选
（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌原理
刚果红种染料纤维素样糖物质形成红色复合物水解纤维二糖葡萄糖发生种反应含纤维素培养基中加入刚果红时刚果红培养基中纤维素形成红色复合物纤维素纤维素酶分解刚果红－纤维素复合物法形成培养基中会出现纤维素分解菌中心透明圈样通否产生透明圈筛选纤维素分解菌
三分离分解纤维素微生物实验流程
土壤取样→选择培养（步否需应根样品中目菌株数量少确定）→梯度稀释→样品涂布鉴纤维素分解菌培养基→挑选产生透明圈菌落
（1）土壤采集：选择富含纤维素环境
（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌步骤：倒板操作制备菌悬液涂布板
（3）刚果红染色法种类：
种先培养微生物加入刚果红进行颜色反应种倒板时加入刚果红
四课题延伸
分解纤维素微生物进行初步筛选分离纯化第步确定纤维素分解菌需进行发酵产纤维素酶实验纤维素酶发酵方法液体发酵固体发酵两种纤维素酶测定方法般纤维素酶分解滤纸等纤维素产生葡萄糖进行定量测定
五疑难解答
（1）什富含纤维素环境中寻找纤维素分解菌？
生物环境相互存关系富含纤维素环境中纤维素分解菌含量相提高种土样中获目微生物率高普通环境
（2）滤纸埋土壤中什作？认滤纸应该埋进土壤深？
滤纸埋土壤中纤维素分解菌相聚集实际工设置纤维素分解菌生存适宜环境般应纸埋深约10cm左右腐殖土壤中
（3）两种刚果红染色法较
方法传统方法缺点操作繁琐加入刚果红溶液会菌落间发生混杂优点样显示出颜色反应基纤维素分解菌作
方法二优点操作简便存菌落混杂问题缺点纤维素琼脂土豆汁中含淀粉类物质够产生淀粉酶微生物出现假阳性反应种产生淀粉酶微生物产生透明圈较模糊培养基中纤维素占位纤维素酶产生透明圈相区分方法二缺点：微生物具降解色素力长时间培养程中会降解刚果红形成明显透明圈纤维素分解菌易区分
（4）什选择培养够浓缩需微生物？
选择培养条件够适应种营养条件微生物迅速繁殖适应种营养条件微生物繁殖抑制起浓缩作
果酒果醋制作
实验原理
酶
1．酒精发酵原理：
酶
① 酵母菌进行氧呼吸量繁殖表达式：C6H12O6+O2→CO2+H2O+量
② 酵母菌进行氧呼吸产生酒精二氧化碳表达式：C6H12O6→C2H5OH+CO2+量
③ 酵母菌营养代谢类型异养兼性厌氧型氧时酵母菌量繁殖起发酵效果氧时繁殖速度减慢时进行发酵利酵母菌发酵时先通入足够菌空气氧环境段时间繁殖隔绝氧气进行发酵20℃左右适合酵母菌繁殖酒精发酵佳温度18℃～25℃pH弱酸性
酶
2．醋酸发酵原理：
① 醋酸菌氧型细菌缺少糖源时氧条件乙醇（酒精）氧化成醋酸
表达式：C2H5OH+O2→CH3COOH+H2O
氧气糖源充足时醋酸菌葡萄汁中糖分解成醋酸
醋酸菌生长佳温度30℃～35℃
二实验步骤
1 发酵瓶纱布榨汁机盛葡萄汁器皿等实验具进行清洗消毒先温水反复洗次体积分数75酒精擦拭消毒晾干
2 取葡萄500 g枝梗腐烂子粒
3 清水洗葡萄1～2遍污物注意反复次洗
4 榨汁机榨取葡萄汁装入发酵瓶中葡萄成浆洁净纱布滤发酵瓶中盖瓶盖果没合适发酵装置500 mL塑料瓶代注入果汁量超塑料瓶总体积23
5 发酵瓶置适宜温度发酵
6 发酵旺盛期CO2产量非常需时排气防止发酵瓶爆裂果简易发酵装置瓶子（选塑料瓶）天拧松瓶盖2～4次进行排气
7 10 d开始进行取样检验工作例检验酒味酒精含量进行酵母菌镜检等工作
8 果酒制成发酵液中加入醋酸菌醋曲然装置转移30～35 ℃条件发酵适时发酵液中充气果找醋酸菌菌种醋曲尝试然接种效果果没充气装置瓶盖开瓶口盖纱布减少空气中尘土等污染
三注意事项
请分析装置中充气口排气口出料口分作什排气口通长弯曲胶瓶身连接？结合果酒果醋制作原理认应该发酵装置？
充气口 排气口
出料口
答：充气口醋酸发酵时连接充气泵进行充气排气口酒精发酵时排出CO2出料口取样排气口通长弯曲胶瓶身连接目防止空气中微生物污染该装置制酒时应该关闭充气口制醋时应充气口连接气泵输入氧气
腐乳制作
实验原理
1．参豆腐发酵微生物青霉酵母曲霉毛霉等种中起作毛霉
2．毛霉种丝状真菌营养代谢类型异养需氧型适生长温度1518℃常见土壤水果蔬菜谷物具发达白色菌丝
3毛酶等微生物产生蛋白酶豆腐中蛋白质分解成分子肽氨基酸脂肪酶脂肪分解成甘油脂肪酸
二实验步骤
1豆腐切成3cm×3cm×1cm干块豆腐含水量70％左右水分腐乳易成形
2豆腐块放铺干粽叶盘粽叶提供菌种起保温作块豆腐等距离排放周围留定空隙豆腐面铺干净粽叶气候干燥时盘保鲜膜包裹封严免湿度太高利毛霉生长
3盘放入温度保持15～18 ℃方毛霉逐渐生长约5 d豆腐表面丛生着直立菌丝
4毛霉生长旺盛呈淡黄色时包裹盘保鲜膜铺面粽叶豆腐块热量水分够迅速散失时散霉味程般持续36 h
5豆腐凉透豆腐间连接起菌丝拉断整齐排列容器准备腌制
6长满毛霉豆腐块（称毛坯）盐质量分数5∶1培养毛坯时盘没长直立菌丝面统玻璃瓶边毛坯分层盘立摆放容器中分层加盐层加高增加盐量瓶口表面铺盐厚防止杂菌瓶口进入约腌制8 d
〔注：加盐析出豆腐中水分利腐乳成型盐够抑制微生物生长调味盐腌制时注意盐量盐浓度低足抑制微生物生长导致豆腐腐败变质盐浓度高会影响腐乳口味〕
7黄酒米酒糖口味配种香辛料（胡椒花椒八角茴香桂皮姜辣椒等）混合制成卤汤卤汤酒精含量控制12％左右宜
〔注：酒精含量高低腐乳期发酵时间长短关系酒精含量越高蛋白酶抑制作越腐乳成熟期延长酒精含量低蛋白酶活性高加快蛋白质水解杂菌繁殖快豆腐易腐败难成块〕
8广口玻璃瓶刷干净高压锅100 ℃蒸汽灭菌30 min腐乳咸坯摆入瓶中加入卤汤辅料瓶口酒精灯加热灭菌胶条密封常温情况般六月成熟
三注意事项
1酿造腐乳生产工序豆腐进行前期发酵期发酵前期发酵发生变化毛霉豆腐（白坯）生长发酵温度15～18 ℃温度适细菌酵母菌曲霉生长适毛霉慢慢生长毛霉生长约5 d白坯变成毛坯前期发酵作豆腐表面层菌膜包住形成腐乳体二毛霉分泌蛋白酶种酶利豆腐含蛋白质水解种氨基酸期发酵酶微生物协参生化反应程通腌制配入种辅料（红曲面曲酒酿）蛋白酶作缓慢促进生化反应生成腐乳香气
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