附件1
肿瘤相关突变基检测试剂（高通量测序法）性评价通注册技术审查指导原
指导原旨指导注册申请肿瘤相关基检测试剂分析性评价注册申报资料准备撰写时技术审评部门注册申报资料技术审评提供参考
指导原针肿瘤相关基检测试剂分析性评价般求申请应产品具体特性确定中容否适适需具体阐述理相应科学产品具体特性注册申报资料容进行充实细化
指导原申请审查员指导性文件包括注册审批涉行政事项作法规强制执行果够满足相关法规求方法采需详细阐明理科学合理性进行验证提供详细研究资料验证资料相关员应遵循相关法规前提指导原
指导原现行法规标准体系前认知水制定着法规标准断完善科学技术断发展指导原相关容适时进行调整
适范围
指导原述肿瘤相关基检测试剂分析性评价指基高通量测序（highthroughput sequencing）代测序（next generation sequencingNGS）称规模行测序（massively parallel sequencingMPS）体外检测体组织肿瘤细胞中肿瘤相关基变异检测体细胞突变NGS正广泛肿瘤诊疗相关分子检测包括特定基DNARNA进行测序寻找肿瘤床诊疗相关基变异肿瘤基突变类型包括点突变插入缺失基重排拷贝数异常等广义基突变
基NGS测序原理体外诊断（In Vitro DiagnosisIVD）检测包括步骤：样收集处理保存核酸提取处理文库制备测序碱基识序列变异识滤变异注释解读检测报告生成时某产品会包括软件部分述相关步骤定全部包括应根产品具体设计流程进行判断检测步骤申请需结合产品设计床意义建立特定接受质量评价指标合格判断标准外满足产品特定预期途申请需通科学适检测性研究确定适试剂消耗品仪器软件基述考虑素NGS检测产品设计工作流程中差异均导致结果申请需清楚描述相关检测性指标
分析性评价初衷提出产品性效性安全性相关问题假设然通研究进行确认NGS测序通量发现未知基变异方面具优势NGS技术应需求中存包括相关床样收集处理NGS检测容测序流程数分析结果报告等方面挑战
指导原重点关注实体瘤中检测具床意义体细胞变异确保高质量检测结果申请应患者利益中心充分整合床肿瘤学家精准诊治观点充分考虑国推广应操作性申请采样化靶基组合检测靶基产生信息会诊断分类指导治疗决策特定肿瘤提供预评价产品包含基数量存较差异
指导原适进行首次注册申报相关许事项变更产品指导原适全外显子检测肿瘤全基组测序头测序游离DNA检测RNA直接测序病原体微生物宏基组学测序胚胎植入前检测疾病风险（含遗传风险）评估预测直接面消费者测序健康群筛查
二NGS性评价
（）综述资料
综述资料包括产品预期途产品描述关生物安全性说明研究结果总结评价类产品市情况介绍等容
申请计划开发针性基检测试剂时需确定预期途测基数量检测突变位点者突变类型包括检测样类型适群类型检测信息评估报告应考虑影响检测设计验证质量控制素试剂组成说明书中详细说明该产品包含试剂组分需未提供试剂设备耗材
作IVD检测般原申请应首先定义申报产品预期途检测性产品预期途直接影响检测设计检测性测序报告基类型申请需前瞻性确定应进行研究指标（例准确性）种研究指标应该满足标准设计开发完成验证研究否满足预定义性果检测符合预定义性标准应分析原重新验证修改预定义性指标通反复设计开发验证直检测满足设定需求整程中申请需记录研究方案研究程结果项研究设计理建议申请列出样处理文库制备测序生信分析等环节质量控制参数文库浓度片段长度碱基识质量值（Base Call Quality scores）滤效Reads数效测序深度（重处理等）符合低测序深度均测序深度求区域（）等
申请应提供整检测流程标准操作程序文件（Standard Operating ProcedureSOP）NGS技术检测全程包括样收集处理文库制备测序数分析结果报告等程进行描述生物信息学分析方面描述记录数处理分析包括变异识滤注释程明确软件包括源（例：部开发第三方）修改建议列表形式描述需软件数库名称版功
（二）原材料研究资料
NGS检测程包括样收集处理文库制备测序数分析结果报告等
1样收集处理（适）
样收集处理程保证样具实反映患者体征关键环节申请需提交涉样收集处理相关试剂原材料信息样前处理试剂样运输保存试剂核酸提取试剂组成成分等
2文库制备测序
测序文库构建测序程中需试剂包含脱氧核糖核苷三磷酸连接酶聚合酶逆转录酶限制性切酶引物探针接头等申请行研究原材料申请应测序文库构建实验程予详述提供原材料功性研究制备完成原料成品进行质量检验确认符合标准求整生产工艺应稳定控申请外购原材料应详述种原材料外购方源提交外购方出具种原材料性指标质量控制资料详述申请外购原材料指标质量求确定该原材料作产品原材料详细核酸类检测试剂包装材料耗材应脱氧核糖核酸酶（DeoxyribonucleaseDNase）核糖核酸酶（RibonucleaseRNase）污染
3生物信息分析数库求
NGS数分析流程生物信息学流程般分碱基识序列变异识变异注释等明确参考序列类型突变类型需开发变异突变检测算法次应根产品设计类型提供软件工具范围需验证类型涉数库建议申请提交数库溯源信息数库类型完整性实时性维护分析软件版性验证等资料
4参考品求
部参考品保证产品性稳定性检测值溯源重构成参考品研究应包括原料选择制备程定值研究评价指标等申请应部阳性阴性参考品源基序列设置等信息进行验证提供参考品溯源程测量程序参考方法相关信息详细验证资料
具体求：
41阳性参考品阳性质控品：
411阳性参考品
理想状态阳性参考品应包括申报产品基型质控样考虑基NGS技术检测基数量较申请应结合产品预期途床意义基类型等素进行针性代表性设计
明确肿瘤伴诊断相关基应考虑该类基参考品设置合理性完整性需包括伴诊断相关全部热点基建议采床样细胞系提取核酸储备液作原料
具显著床意义潜床意义基应考虑代表性问题明确具床诊断意义基类型基型中变异类型突变频率变异类型选取应具代表性包括外显子基变异突变等
检测编码区较存非热点区域设计（1M）建议阳性参考品中考虑检测整体区域灵敏度验证（关注SNV等）混合永生化正常白细胞DNA储存液等
突变变异变异丰度突变频率浓度范围设置应具代表性提供样设定阳性参考品突变形式拷贝数需采效方法进行确认明确接受标准申请设计阳性参考品时考虑检测限参考品设置确认方式提供相关
412阳性质控品
模拟病样目标核酸序列质控整检测程包括核酸提取（适）文库构建测序数分析目前阳性质控检测分析程应床样方式致
42阴性参考品阴性质控品
阴性参考品阴性质控品建议正常床样混合物细胞系应明确含目标区域肿瘤突变基
43精密度参考品
精密度参考品设置求参考阳性阴性参考品
44 PCR 试剂模板质控品（No Template ControlNTC）（适）
申请应根申报产品特点设置NTC质控品检测接受标准监测检测程中否存污染
（三）生产工艺反应体系研究资料
NGS检测复杂工作流程独立步骤组合成般言检测组成部分申请应建立特定检测指标验收标准必须NGS操作流程性表现进行部验证步流程需分优化佳验值综合决定佳实验操作条件参数设置
1应反应体系涉基容床样量试剂量反应条件质控体系设置等提供确切配制工作液种原材料配应符合求
2生产工艺反应原理介绍逆转录程（涉）佳反应体系研究资料包括酶浓度引物探针浓度脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleotide triphosphatedNTP）浓度阳离子浓度等
3申报产品包含核酸分离纯化试剂应提交核酸分离纯化程进行工艺优化研究资料包括限核酸体积质量浓度纯度完整性等核酸浓度纯度检测方法包括限荧光法等核酸完整性检测方法包括限琼脂糖凝胶法等
（四）分析性评估资料
分析性评估反映产品原材料选择生产工艺反应体系等方面素设置否合理客观评价指标检测试剂性研究方案应结合产品反应原理床预期途条件等综合素进行设计性研究应涵盖产品研制阶段试剂盒进行性验证研究资料包括具体研究方法控标准实验数统计分析等详细资料
部分容NGS检验流程中质量控制求性指标两部分进行阐述：
1NGS检验流程
检测方法中应明确检测素（仪器软件消耗品试剂）确定设计方案标准详细记录设计研究程基NGS检测组成应该确定规范记录记录检测组成关键素（覆盖率碱基质量等）局限性确定记录基组检测区域包括基变异类型果关键测序区域符合低性求（覆盖标准等）应修改检测重新验证达低性求时应产品说明书标签中明确影响限制产品检测性情形
11样制备
申请需考虑接受检测样类型检测结果影响应明确组织样采集标准肿瘤组织突变基检测标进行检测前须肿瘤细胞进行评估肿瘤细胞占例需达续检测方法求
NGS检测试剂设计开发程中申请应配套核酸提取分离纯化富集试剂进行验证提供验证方案应明确样品质量（包括限核酸浓度纯度完整性）低求进行质量控制分离纯化核酸储备液质量（浓度范围）符合求应重新取材扩样量进行核酸分离纯化
12测序文库制备
文库制备产生特定范围DNAcDNA片段程文库质量非常重申请应建立文库构建浓度文库片段求文库浓度检测方法包括限实时荧光定量PCR法文库片段检测方法包括限毛细电泳法等申请应关注测序台性特点确保片段长度分布符合续测序求需进行片段化处理申请应制定核酸序列片段化操作流程质量控制方案片段化核酸短序列浓度片段分布等参数进行验证
文库制备关键步骤DNA片段两端连接测序接头接头序列段设计序列包含测序程目序列组分启动测序反应通测序引物序列PCR扩增引物序列锚定序列索引（条形码）序列等申请采定义序列应提供设计研究资料加接头独立步骤靶序列富集程中添加申请条码标签时需充分验证满足测序质量求测序深度覆盖度等条件申请应报告效条码标签数量条码标签序列位置详细清晰记录
13测序碱基读取
目前测序台具测序方法包括联合探针锚定聚合测序法边合成边测序离子半导体测序检测方法技术性相似台间存差异特DNA输入量求测序通量运行时间测序读长碱基识技术差异会影响仪器处理低质量样力检测插入缺失融合等变异类型力样通量
申请应根选测序台选择合适参数指标测序质量进行监控制定相应理制度质量标准明确失控情况纠正措施申请应根具体应情况测序区域序列特征等素确定测序需覆盖度深度测序程中申请应建立标准操作流程质量控制方案监控整测序程中测序质量
申请应描述清晰确立测序深度时需明确指出均测序深度低测序深度需说明测序数类型原始测序数（原始reads数）滤高质量测序数重复测序深度
碱基识指识段基序列片段位点核苷酸程测序台具测序偏性影响碱基读取程中错误类型率碱基读取申请应碱基读取质量进行评估
14生物信息学分析
申请应生物信息学分析流程完整记录建立完善生物信息学分析软件版控制方案申请应建立生物信息学分析标准操作流程质量控制方案保证测序数分析解读报告准确性严谨性生物信息学分析流程应描述清晰包括步骤软件名称版参数设置求包括限指标：说明检查位点碱基质量值读段均质量值碱基频率分布读长分布否存重复序列工序列评价方法保证该流程生物信息学分析结果复现生物信息学分析应少报告具明确床指导意义结果
生物信息学分析般包括限数预处理数质控变异识变异注释根测序类型检测报告变异类型选择生物信息流程考虑变异识评估流程程中限制素第三方生物信息学工具整生物信息流程影响
141数预处理：申请应说明分析流程软件类型数预处理步骤数文件（FASTQ格式文件）应包含质控参数位点碱基质量值控制参数GC含量序列长度分布等明确测序碱基质量值（Base Call Quality质量值Q值分）阈值明确判定实验效符合碱基质量值低百分采方法应提供研究资料选择
142数质控：申请应提供BAM （Sequence AlignmentMap）文件生成程软件类型样数参数标准判定实验效低接受标准提供参考序列选择特殊序列应提供采该序列
143突变分析：根申报产品检测基类型申请应确认软件工具类型选择明确基类型质控标准判定实验效低接受标准
144突变注释：申请应提供突变预测功性作床解释注释形成程数源
15软件研究（适）
根申报产品预期途存软件产品包含申报产品组成成分中生物信息分析程中需该软件该软件视检测系统部分申请应提供该部分软件相关适性研究资料
16 NGS数存储传输享（适）
储存原始分析检测结果建议申请提交数存储中心安全性稳定性维护升级方案异常情况处置方案等资料
17公部数库应（适）
申报产品测序结果需助公部数库进行结果注释报告解读申请需提供公部数库产品检测中起作说明公部数库类型功介绍版号标准操作流程质量控制方案等
2性指标
分析性验证包括通组预定义性评价方式证明性否足满足预期途符合预定义性标准通常涉否符合统计学评价求检测否存患者疾病相关变异等
21分析性样设置求
申请应提供评估项性研究标数量类型设定根产品预期途样研究应包括代表性变异变异类型研究应考虑检测适应症相关床意义区域跨基区域变异难测序难基区域工混合嵌合体变异类型检测区域例：果检测旨检测报告插入缺失位点等应包括限基片段突变区域等
应研究中含检测适应症相关床样床样应具适代表性确保覆盖申报产品声称床相关序列变异等
22准确性
221总体求
准确性包括检测值检测值间致性基NGS测序原理检测通适方法较核酸测序验证方法评估申报产品准确性根检测性指标准确性研究应包括代表性变异变异类型验证（准确性研究样求详见21分析性样设置求）
种变异类型代表性床相关变异应考虑变异频率变异类型确定检测变异类型检测测序区域（变异否具致病性）具代表性参考物质具高置信度样进行研究床相关变异准确性计算包含基床样研究数床样相关指标
准确性研究中应含代表性床相关变异检测适应症床样确保床相关序列变异检测报告准确性评估采前瞻性床样时收集处理方式应产品预期途致果前瞻性床样床相关区域中含特定变异冻存床样类细胞系样代补充研究
根评价方法方法变异检测结果分计算阳性符合率（Positive Percent AgreementPPA）阴性符合率（Negative Percent AgreementNPA）阳性预测值（Positive Predictive ValuePPV）通检测评估种类型变异单核苷酸态性（Single Nucleotide VariantSNV）插入结构变异测序区域范围（高度源高度态困难区域）分计算PPANPA等
表1 准确性评估方法
方法
总数
阳性
阴性
检测方法
阳性
A
B
A+B
阴性
C
D
C+D
总数
A+C
B+D
A+B+C+D
表1注：PPA通A（真阳性结果数）（A+C）NPA通D（真阴性结果数）（B+D）计算应包含应答效应答应答效应答结果应单独列出（见表2）根适情况计算种变体类型床相关变异PPANPA等
表2 准确性评估方法
方法
总数
阳性
阴性
检测方法
阳性
A
B
A+B
阴性
C
D
C+D
应答效应答
E
F
E+F
总数
A+C+E
B+D+F
N
表2注：准确性研究中应答效应答百分应该估计（E + F） N95％双侧置信区间外应评价阳性结果中应答效应答E （A + C + E）阴性结果中应答效应答F （B + D + F）申请应设定应答效应答接受标准提供样总数（N A + B + C + D + E + F）申请应应答效应答产生原进行分析注意区分应答效结果模棱两结果质控正常结果法识情况等
222参考品准确性
水突变位点阳性参考品均应求检出阳性考虑浓度梯度突变梯度应水阳性参考品设置相应检出求阴性参考品引物探针组合检测条件均应检出阴性
23检测限
明确接受低检测限（Limit of DetectionLoD）明确效应答应答检测结果接受标准预期途中包含种变异类型建立LoD果检测工混合样（嵌合样）需考虑等位基率确定检测限
试剂LoD研究中应常规床实验室条件确定样类型进行通常LoD值采分析物低浓度计算出浓度相应检测重复中获少95阳性检出接受水应答效应答变异类型具LoD时需计算序列测区域范围中变异类型LoDNGS检测方法时检测种类型突变基灵敏度设置应根突变基类型判读方式进行验证
24空白限（检测基线）
应确认会报告区域质量分数覆盖率产生负面影响应包含具代表性基区域变异类型序列背景进行验证研究设置空白检测限检测标准设定评价方案方法
25分析特异性
分析特异性评估产品仅检测预期测变异力根预期途产品设计潜源性外源性物质干扰交叉反应交叉污染会产品检测性产生影响
交叉反应（源区域假基类型交叉反应序列）导致错误检测产生假阳性结果患者标交叉污染正常序列引入检测中导致假阳性假阴性结果应选择产品预期途覆盖样样类型DNA提取方法中相关干扰物质开展研究时应已知交叉反应等位基源区域进行评估
26精密度
精密度研究指相样（包括检测界值附样）种特定条件进行检测（操作员操作条件检测天数仪器等）考虑检测中变异源申请应评估变异野生型基精密度中应分报告检测区域变异类型检测值申请应客观证效统计方法验证指标设定标准
导致检测结果样性素进行评价包括限检测样检测批间适机型试剂批次检测天数操作员
外申请应考虑外部素相情况应进行申报试剂相相似测物重复性检测评价检测结果申请需检测条件检测区域变异类型精密度分进行报告应报告应答效应答百分
27体细胞胚系突变鉴研究（适）
申请需提交资料明确申报产品效鉴胚系突变申请种方法应遵循保证准确检测原：肿瘤样进行检测时该患者正常配样（正常癌旁组织外周血白细胞）进行检测根配样癌组织样中鉴定出突变信息进行鉴筛选应确认样中特基态性明确混合态性位点预期频率配样时申请需提供效区分体细胞突变胚系突变鉴定标准提供相关研究资料
28批次互通性（适）
NGS检测通常包括试剂消耗品仪器软件部分相独立申请需批次间否互通进行研究
29生物分析流程性补充研究（适）
床样细胞系生物合成材料法完全覆盖生物分析流程时含种求类型已知序列变异（：SNV插入缺失结构变异等）计算机构建序列标申请采软件编辑满足验证需模拟样数学模型生物分析流程进行补充验证数文件应申报产品相预分析分析方法生成需注意编辑样代生物学样作生物学样满足验证条件补充情形
210
评估检测局限性时申请应采特殊样特定插入缺失重排确定检测法预期准确度精确度检测序列变化类型果区域申报产品检测预期途部分需验证高度源高度态困难区域变异检测性果检测基区域部分难测序达性阈值应该报告检测局限性适申请应记录申报产品会报告检测类型
设计验证程中申请应记录检测失败情况分析原例未满足检测运行质量指标等符合质量标准检测区域应报告变异结果未达检测运行质量标准未检测区域应实报告
申报产品市通市床数收集分析药品说明书中明确具伴诊断途基改变原反应体系检测方式等情况申请通收集产品床效性资料申请变更床途
三名称解释
通量测序（Highthroughput sequencing）：称代测序技术（Nextgeneration sequencing）次性数百万条核酸分子进行规模行测序
全基组测序：某种生物基组中全部碱基进行测序细胞完整基组序列第DNA分子开始直DNA分子完整检出序排列
头测序（de novo sequencing）：赖已知基组参考序列序列信息直接某物种全基组DNA进行测序然利生物信息学工具机序列进行拼接组装获该基组全序列连续片段
永生化正常白细胞：正常白细胞进行体外培养通基转染等技术外源性永生化基病毒原癌基抑癌基突变体等导入目细胞增加永生化发生率永生化细胞株
变异丰度：变异基型基型中占例计算方式变异基型数量野生型变异型基总量
变异频率：变异基型总群中基频率
原始reads数：高通量测序测序机数总reads数
效测序深度（重处理等）：PCR重复等均深度
符合低测序深度均测序深度求区域（）：低测序深度均测序深度均阈值区域数区域总数值
GC含量（GC content）：测序碱基中G（鸟嘌呤）C（胞嘧啶）两种碱基数碱基数值
覆盖率：测序覆盖区域占总目标区域例
覆盖标准：测序覆盖区域占总目标区域例阈值
碱基识质量值（base call quality scores）：衡量测序质量重指标指测序碱基性程度基高通量测序中测碱基会出相应质量值（base call qualityQ）衡量测序准确度质量值越高表示碱基识越碱基测错概率越
锚定序列：测序芯片机分布两种寡核苷酸序列测序文库结合
索引（条形码）序列：index标签序列barcode标签序列指文库构建程中引入段标签序列样品时测序时区分样序列
应答效应答：测序结果失败测序数低质量控制标准判定结果效
四参考文献
1李金明等高通量测序技术科学出版社 201812
2王忻琨新代测序数分析科学出版社 20182
3Stuart MBrown第二代测序信息处理科学出版社 20171
4步宏叶丰等床分子病理NGS100问简明问答（第版）
5中国食品药品检定研究院第二代测序技术检测试剂质量评价通技术指导原
6 EVALUATION OF AUTOMATIC CLASS III DESIGNATION FOR MSKIMPACT （Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets）
7 The Association for Molecular PathologyAmerican Society of Clinical Oncologyand College of American Pathologists Standards and Guidelines for the Interpretation and Reporting of Sequence Variants in Cancer The Journal of Molecular DiagnosticsVol 19No 1January 2017
8Verification and Validation of Multiplex Nucleic Acid AssaysApproved Guideline Clinical and Laboratory Standards Institute NCCLSMM17AVol28 No9ISBN 1562386611
9Guidelines for Diagnostic NextGeneration Sequencing European Journal of Human Genetics201524（1）：15841589
10ACMG Clinical Laboratory Standards for NextGeneration Sequencing Genetics in Medicine201315（9）
11Ewing ADHoulahan KEHu YEllrott KCaloian CYamaguchi TNBare JCP＇ng CWaggott DSabelnykova VY et al：Combining tumor genome simulation with crowdsourcing to benchmark somatic singlenucleotidevariant detection Nature methods 201512（7）：623630
12FDAConsiderations for DesignDevelopmentand Analytical Validation of Next Generation Sequencing （NGS）– Based In Vitro Diagnostics （IVDs）Intended to Aid in the Diagnosis of Suspected Germline Diseases
13FDAUse of public human genetic variant databases to support clinical validity for genetic and genomicbased in vitro diagnosticsDocument issued on April 132018
14 FoundationFocus™ CDxBRCA Technical Information Summary
15中国肿瘤驱动基分析联盟（CAGC）中国床肿瘤学会（CSCO）二代测序（NGS）技术应床肿瘤精准医学诊断识第版（试行）20160423
16中国床肿瘤学会肿瘤标志物专家委员会中国肿瘤驱动基分析联盟二代测序技术肿瘤精准医学诊断中应专家识 中华医学杂志98（26）2018710
五起草单位
国家药品监督理局医疗器械技术审评中心
文档香网(httpswwwxiangdangnet)户传
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肿瘤相关突变基检测试剂（高通量测序法）性评价通注册技术审查指导原
指导原旨指导注册申请肿瘤相关基检测试剂分析性评价注册申报资料准备撰写时技术审评部门注册申报资料技术审评提供参考
指导原针肿瘤相关基检测试剂分析性评价般求申请应产品具体特性确定中容否适适需具体阐述理相应科学产品具体特性注册申报资料容进行充实细化
指导原申请审查员指导性文件包括注册审批涉行政事项作法规强制执行果够满足相关法规求方法采需详细阐明理科学合理性进行验证提供详细研究资料验证资料相关员应遵循相关法规前提指导原
指导原现行法规标准体系前认知水制定着法规标准断完善科学技术断发展指导原相关容适时进行调整
适范围
指导原述肿瘤相关基检测试剂分析性评价指基高通量测序（highthroughput sequencing）代测序（next generation sequencingNGS）称规模行测序（massively parallel sequencingMPS）体外检测体组织肿瘤细胞中肿瘤相关基变异检测体细胞突变NGS正广泛肿瘤诊疗相关分子检测包括特定基DNARNA进行测序寻找肿瘤床诊疗相关基变异肿瘤基突变类型包括点突变插入缺失基重排拷贝数异常等广义基突变
基NGS测序原理体外诊断（In Vitro DiagnosisIVD）检测包括步骤：样收集处理保存核酸提取处理文库制备测序碱基识序列变异识滤变异注释解读检测报告生成时某产品会包括软件部分述相关步骤定全部包括应根产品具体设计流程进行判断检测步骤申请需结合产品设计床意义建立特定接受质量评价指标合格判断标准外满足产品特定预期途申请需通科学适检测性研究确定适试剂消耗品仪器软件基述考虑素NGS检测产品设计工作流程中差异均导致结果申请需清楚描述相关检测性指标
分析性评价初衷提出产品性效性安全性相关问题假设然通研究进行确认NGS测序通量发现未知基变异方面具优势NGS技术应需求中存包括相关床样收集处理NGS检测容测序流程数分析结果报告等方面挑战
指导原重点关注实体瘤中检测具床意义体细胞变异确保高质量检测结果申请应患者利益中心充分整合床肿瘤学家精准诊治观点充分考虑国推广应操作性申请采样化靶基组合检测靶基产生信息会诊断分类指导治疗决策特定肿瘤提供预评价产品包含基数量存较差异
指导原适进行首次注册申报相关许事项变更产品指导原适全外显子检测肿瘤全基组测序头测序游离DNA检测RNA直接测序病原体微生物宏基组学测序胚胎植入前检测疾病风险（含遗传风险）评估预测直接面消费者测序健康群筛查
二NGS性评价
（）综述资料
综述资料包括产品预期途产品描述关生物安全性说明研究结果总结评价类产品市情况介绍等容
申请计划开发针性基检测试剂时需确定预期途测基数量检测突变位点者突变类型包括检测样类型适群类型检测信息评估报告应考虑影响检测设计验证质量控制素试剂组成说明书中详细说明该产品包含试剂组分需未提供试剂设备耗材
作IVD检测般原申请应首先定义申报产品预期途检测性产品预期途直接影响检测设计检测性测序报告基类型申请需前瞻性确定应进行研究指标（例准确性）种研究指标应该满足标准设计开发完成验证研究否满足预定义性果检测符合预定义性标准应分析原重新验证修改预定义性指标通反复设计开发验证直检测满足设定需求整程中申请需记录研究方案研究程结果项研究设计理建议申请列出样处理文库制备测序生信分析等环节质量控制参数文库浓度片段长度碱基识质量值（Base Call Quality scores）滤效Reads数效测序深度（重处理等）符合低测序深度均测序深度求区域（）等
申请应提供整检测流程标准操作程序文件（Standard Operating ProcedureSOP）NGS技术检测全程包括样收集处理文库制备测序数分析结果报告等程进行描述生物信息学分析方面描述记录数处理分析包括变异识滤注释程明确软件包括源（例：部开发第三方）修改建议列表形式描述需软件数库名称版功
（二）原材料研究资料
NGS检测程包括样收集处理文库制备测序数分析结果报告等
1样收集处理（适）
样收集处理程保证样具实反映患者体征关键环节申请需提交涉样收集处理相关试剂原材料信息样前处理试剂样运输保存试剂核酸提取试剂组成成分等
2文库制备测序
测序文库构建测序程中需试剂包含脱氧核糖核苷三磷酸连接酶聚合酶逆转录酶限制性切酶引物探针接头等申请行研究原材料申请应测序文库构建实验程予详述提供原材料功性研究制备完成原料成品进行质量检验确认符合标准求整生产工艺应稳定控申请外购原材料应详述种原材料外购方源提交外购方出具种原材料性指标质量控制资料详述申请外购原材料指标质量求确定该原材料作产品原材料详细核酸类检测试剂包装材料耗材应脱氧核糖核酸酶（DeoxyribonucleaseDNase）核糖核酸酶（RibonucleaseRNase）污染
3生物信息分析数库求
NGS数分析流程生物信息学流程般分碱基识序列变异识变异注释等明确参考序列类型突变类型需开发变异突变检测算法次应根产品设计类型提供软件工具范围需验证类型涉数库建议申请提交数库溯源信息数库类型完整性实时性维护分析软件版性验证等资料
4参考品求
部参考品保证产品性稳定性检测值溯源重构成参考品研究应包括原料选择制备程定值研究评价指标等申请应部阳性阴性参考品源基序列设置等信息进行验证提供参考品溯源程测量程序参考方法相关信息详细验证资料
具体求：
41阳性参考品阳性质控品：
411阳性参考品
理想状态阳性参考品应包括申报产品基型质控样考虑基NGS技术检测基数量较申请应结合产品预期途床意义基类型等素进行针性代表性设计
明确肿瘤伴诊断相关基应考虑该类基参考品设置合理性完整性需包括伴诊断相关全部热点基建议采床样细胞系提取核酸储备液作原料
具显著床意义潜床意义基应考虑代表性问题明确具床诊断意义基类型基型中变异类型突变频率变异类型选取应具代表性包括外显子基变异突变等
检测编码区较存非热点区域设计（1M）建议阳性参考品中考虑检测整体区域灵敏度验证（关注SNV等）混合永生化正常白细胞DNA储存液等
突变变异变异丰度突变频率浓度范围设置应具代表性提供样设定阳性参考品突变形式拷贝数需采效方法进行确认明确接受标准申请设计阳性参考品时考虑检测限参考品设置确认方式提供相关
412阳性质控品
模拟病样目标核酸序列质控整检测程包括核酸提取（适）文库构建测序数分析目前阳性质控检测分析程应床样方式致
42阴性参考品阴性质控品
阴性参考品阴性质控品建议正常床样混合物细胞系应明确含目标区域肿瘤突变基
43精密度参考品
精密度参考品设置求参考阳性阴性参考品
44 PCR 试剂模板质控品（No Template ControlNTC）（适）
申请应根申报产品特点设置NTC质控品检测接受标准监测检测程中否存污染
（三）生产工艺反应体系研究资料
NGS检测复杂工作流程独立步骤组合成般言检测组成部分申请应建立特定检测指标验收标准必须NGS操作流程性表现进行部验证步流程需分优化佳验值综合决定佳实验操作条件参数设置
1应反应体系涉基容床样量试剂量反应条件质控体系设置等提供确切配制工作液种原材料配应符合求
2生产工艺反应原理介绍逆转录程（涉）佳反应体系研究资料包括酶浓度引物探针浓度脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleotide triphosphatedNTP）浓度阳离子浓度等
3申报产品包含核酸分离纯化试剂应提交核酸分离纯化程进行工艺优化研究资料包括限核酸体积质量浓度纯度完整性等核酸浓度纯度检测方法包括限荧光法等核酸完整性检测方法包括限琼脂糖凝胶法等
（四）分析性评估资料
分析性评估反映产品原材料选择生产工艺反应体系等方面素设置否合理客观评价指标检测试剂性研究方案应结合产品反应原理床预期途条件等综合素进行设计性研究应涵盖产品研制阶段试剂盒进行性验证研究资料包括具体研究方法控标准实验数统计分析等详细资料
部分容NGS检验流程中质量控制求性指标两部分进行阐述：
1NGS检验流程
检测方法中应明确检测素（仪器软件消耗品试剂）确定设计方案标准详细记录设计研究程基NGS检测组成应该确定规范记录记录检测组成关键素（覆盖率碱基质量等）局限性确定记录基组检测区域包括基变异类型果关键测序区域符合低性求（覆盖标准等）应修改检测重新验证达低性求时应产品说明书标签中明确影响限制产品检测性情形
11样制备
申请需考虑接受检测样类型检测结果影响应明确组织样采集标准肿瘤组织突变基检测标进行检测前须肿瘤细胞进行评估肿瘤细胞占例需达续检测方法求
NGS检测试剂设计开发程中申请应配套核酸提取分离纯化富集试剂进行验证提供验证方案应明确样品质量（包括限核酸浓度纯度完整性）低求进行质量控制分离纯化核酸储备液质量（浓度范围）符合求应重新取材扩样量进行核酸分离纯化
12测序文库制备
文库制备产生特定范围DNAcDNA片段程文库质量非常重申请应建立文库构建浓度文库片段求文库浓度检测方法包括限实时荧光定量PCR法文库片段检测方法包括限毛细电泳法等申请应关注测序台性特点确保片段长度分布符合续测序求需进行片段化处理申请应制定核酸序列片段化操作流程质量控制方案片段化核酸短序列浓度片段分布等参数进行验证
文库制备关键步骤DNA片段两端连接测序接头接头序列段设计序列包含测序程目序列组分启动测序反应通测序引物序列PCR扩增引物序列锚定序列索引（条形码）序列等申请采定义序列应提供设计研究资料加接头独立步骤靶序列富集程中添加申请条码标签时需充分验证满足测序质量求测序深度覆盖度等条件申请应报告效条码标签数量条码标签序列位置详细清晰记录
13测序碱基读取
目前测序台具测序方法包括联合探针锚定聚合测序法边合成边测序离子半导体测序检测方法技术性相似台间存差异特DNA输入量求测序通量运行时间测序读长碱基识技术差异会影响仪器处理低质量样力检测插入缺失融合等变异类型力样通量
申请应根选测序台选择合适参数指标测序质量进行监控制定相应理制度质量标准明确失控情况纠正措施申请应根具体应情况测序区域序列特征等素确定测序需覆盖度深度测序程中申请应建立标准操作流程质量控制方案监控整测序程中测序质量
申请应描述清晰确立测序深度时需明确指出均测序深度低测序深度需说明测序数类型原始测序数（原始reads数）滤高质量测序数重复测序深度
碱基识指识段基序列片段位点核苷酸程测序台具测序偏性影响碱基读取程中错误类型率碱基读取申请应碱基读取质量进行评估
14生物信息学分析
申请应生物信息学分析流程完整记录建立完善生物信息学分析软件版控制方案申请应建立生物信息学分析标准操作流程质量控制方案保证测序数分析解读报告准确性严谨性生物信息学分析流程应描述清晰包括步骤软件名称版参数设置求包括限指标：说明检查位点碱基质量值读段均质量值碱基频率分布读长分布否存重复序列工序列评价方法保证该流程生物信息学分析结果复现生物信息学分析应少报告具明确床指导意义结果
生物信息学分析般包括限数预处理数质控变异识变异注释根测序类型检测报告变异类型选择生物信息流程考虑变异识评估流程程中限制素第三方生物信息学工具整生物信息流程影响
141数预处理：申请应说明分析流程软件类型数预处理步骤数文件（FASTQ格式文件）应包含质控参数位点碱基质量值控制参数GC含量序列长度分布等明确测序碱基质量值（Base Call Quality质量值Q值分）阈值明确判定实验效符合碱基质量值低百分采方法应提供研究资料选择
142数质控：申请应提供BAM （Sequence AlignmentMap）文件生成程软件类型样数参数标准判定实验效低接受标准提供参考序列选择特殊序列应提供采该序列
143突变分析：根申报产品检测基类型申请应确认软件工具类型选择明确基类型质控标准判定实验效低接受标准
144突变注释：申请应提供突变预测功性作床解释注释形成程数源
15软件研究（适）
根申报产品预期途存软件产品包含申报产品组成成分中生物信息分析程中需该软件该软件视检测系统部分申请应提供该部分软件相关适性研究资料
16 NGS数存储传输享（适）
储存原始分析检测结果建议申请提交数存储中心安全性稳定性维护升级方案异常情况处置方案等资料
17公部数库应（适）
申报产品测序结果需助公部数库进行结果注释报告解读申请需提供公部数库产品检测中起作说明公部数库类型功介绍版号标准操作流程质量控制方案等
2性指标
分析性验证包括通组预定义性评价方式证明性否足满足预期途符合预定义性标准通常涉否符合统计学评价求检测否存患者疾病相关变异等
21分析性样设置求
申请应提供评估项性研究标数量类型设定根产品预期途样研究应包括代表性变异变异类型研究应考虑检测适应症相关床意义区域跨基区域变异难测序难基区域工混合嵌合体变异类型检测区域例：果检测旨检测报告插入缺失位点等应包括限基片段突变区域等
应研究中含检测适应症相关床样床样应具适代表性确保覆盖申报产品声称床相关序列变异等
22准确性
221总体求
准确性包括检测值检测值间致性基NGS测序原理检测通适方法较核酸测序验证方法评估申报产品准确性根检测性指标准确性研究应包括代表性变异变异类型验证（准确性研究样求详见21分析性样设置求）
种变异类型代表性床相关变异应考虑变异频率变异类型确定检测变异类型检测测序区域（变异否具致病性）具代表性参考物质具高置信度样进行研究床相关变异准确性计算包含基床样研究数床样相关指标
准确性研究中应含代表性床相关变异检测适应症床样确保床相关序列变异检测报告准确性评估采前瞻性床样时收集处理方式应产品预期途致果前瞻性床样床相关区域中含特定变异冻存床样类细胞系样代补充研究
根评价方法方法变异检测结果分计算阳性符合率（Positive Percent AgreementPPA）阴性符合率（Negative Percent AgreementNPA）阳性预测值（Positive Predictive ValuePPV）通检测评估种类型变异单核苷酸态性（Single Nucleotide VariantSNV）插入结构变异测序区域范围（高度源高度态困难区域）分计算PPANPA等
表1 准确性评估方法
方法
总数
阳性
阴性
检测方法
阳性
A
B
A+B
阴性
C
D
C+D
总数
A+C
B+D
A+B+C+D
表1注：PPA通A（真阳性结果数）（A+C）NPA通D（真阴性结果数）（B+D）计算应包含应答效应答应答效应答结果应单独列出（见表2）根适情况计算种变体类型床相关变异PPANPA等
表2 准确性评估方法
方法
总数
阳性
阴性
检测方法
阳性
A
B
A+B
阴性
C
D
C+D
应答效应答
E
F
E+F
总数
A+C+E
B+D+F
N
表2注：准确性研究中应答效应答百分应该估计（E + F） N95％双侧置信区间外应评价阳性结果中应答效应答E （A + C + E）阴性结果中应答效应答F （B + D + F）申请应设定应答效应答接受标准提供样总数（N A + B + C + D + E + F）申请应应答效应答产生原进行分析注意区分应答效结果模棱两结果质控正常结果法识情况等
222参考品准确性
水突变位点阳性参考品均应求检出阳性考虑浓度梯度突变梯度应水阳性参考品设置相应检出求阴性参考品引物探针组合检测条件均应检出阴性
23检测限
明确接受低检测限（Limit of DetectionLoD）明确效应答应答检测结果接受标准预期途中包含种变异类型建立LoD果检测工混合样（嵌合样）需考虑等位基率确定检测限
试剂LoD研究中应常规床实验室条件确定样类型进行通常LoD值采分析物低浓度计算出浓度相应检测重复中获少95阳性检出接受水应答效应答变异类型具LoD时需计算序列测区域范围中变异类型LoDNGS检测方法时检测种类型突变基灵敏度设置应根突变基类型判读方式进行验证
24空白限（检测基线）
应确认会报告区域质量分数覆盖率产生负面影响应包含具代表性基区域变异类型序列背景进行验证研究设置空白检测限检测标准设定评价方案方法
25分析特异性
分析特异性评估产品仅检测预期测变异力根预期途产品设计潜源性外源性物质干扰交叉反应交叉污染会产品检测性产生影响
交叉反应（源区域假基类型交叉反应序列）导致错误检测产生假阳性结果患者标交叉污染正常序列引入检测中导致假阳性假阴性结果应选择产品预期途覆盖样样类型DNA提取方法中相关干扰物质开展研究时应已知交叉反应等位基源区域进行评估
26精密度
精密度研究指相样（包括检测界值附样）种特定条件进行检测（操作员操作条件检测天数仪器等）考虑检测中变异源申请应评估变异野生型基精密度中应分报告检测区域变异类型检测值申请应客观证效统计方法验证指标设定标准
导致检测结果样性素进行评价包括限检测样检测批间适机型试剂批次检测天数操作员
外申请应考虑外部素相情况应进行申报试剂相相似测物重复性检测评价检测结果申请需检测条件检测区域变异类型精密度分进行报告应报告应答效应答百分
27体细胞胚系突变鉴研究（适）
申请需提交资料明确申报产品效鉴胚系突变申请种方法应遵循保证准确检测原：肿瘤样进行检测时该患者正常配样（正常癌旁组织外周血白细胞）进行检测根配样癌组织样中鉴定出突变信息进行鉴筛选应确认样中特基态性明确混合态性位点预期频率配样时申请需提供效区分体细胞突变胚系突变鉴定标准提供相关研究资料
28批次互通性（适）
NGS检测通常包括试剂消耗品仪器软件部分相独立申请需批次间否互通进行研究
29生物分析流程性补充研究（适）
床样细胞系生物合成材料法完全覆盖生物分析流程时含种求类型已知序列变异（：SNV插入缺失结构变异等）计算机构建序列标申请采软件编辑满足验证需模拟样数学模型生物分析流程进行补充验证数文件应申报产品相预分析分析方法生成需注意编辑样代生物学样作生物学样满足验证条件补充情形
210
评估检测局限性时申请应采特殊样特定插入缺失重排确定检测法预期准确度精确度检测序列变化类型果区域申报产品检测预期途部分需验证高度源高度态困难区域变异检测性果检测基区域部分难测序达性阈值应该报告检测局限性适申请应记录申报产品会报告检测类型
设计验证程中申请应记录检测失败情况分析原例未满足检测运行质量指标等符合质量标准检测区域应报告变异结果未达检测运行质量标准未检测区域应实报告
申报产品市通市床数收集分析药品说明书中明确具伴诊断途基改变原反应体系检测方式等情况申请通收集产品床效性资料申请变更床途
三名称解释
通量测序（Highthroughput sequencing）：称代测序技术（Nextgeneration sequencing）次性数百万条核酸分子进行规模行测序
全基组测序：某种生物基组中全部碱基进行测序细胞完整基组序列第DNA分子开始直DNA分子完整检出序排列
头测序（de novo sequencing）：赖已知基组参考序列序列信息直接某物种全基组DNA进行测序然利生物信息学工具机序列进行拼接组装获该基组全序列连续片段
永生化正常白细胞：正常白细胞进行体外培养通基转染等技术外源性永生化基病毒原癌基抑癌基突变体等导入目细胞增加永生化发生率永生化细胞株
变异丰度：变异基型基型中占例计算方式变异基型数量野生型变异型基总量
变异频率：变异基型总群中基频率
原始reads数：高通量测序测序机数总reads数
效测序深度（重处理等）：PCR重复等均深度
符合低测序深度均测序深度求区域（）：低测序深度均测序深度均阈值区域数区域总数值
GC含量（GC content）：测序碱基中G（鸟嘌呤）C（胞嘧啶）两种碱基数碱基数值
覆盖率：测序覆盖区域占总目标区域例
覆盖标准：测序覆盖区域占总目标区域例阈值
碱基识质量值（base call quality scores）：衡量测序质量重指标指测序碱基性程度基高通量测序中测碱基会出相应质量值（base call qualityQ）衡量测序准确度质量值越高表示碱基识越碱基测错概率越
锚定序列：测序芯片机分布两种寡核苷酸序列测序文库结合
索引（条形码）序列：index标签序列barcode标签序列指文库构建程中引入段标签序列样品时测序时区分样序列
应答效应答：测序结果失败测序数低质量控制标准判定结果效
四参考文献
1李金明等高通量测序技术科学出版社 201812
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12FDAConsiderations for DesignDevelopmentand Analytical Validation of Next Generation Sequencing （NGS）– Based In Vitro Diagnostics （IVDs）Intended to Aid in the Diagnosis of Suspected Germline Diseases
13FDAUse of public human genetic variant databases to support clinical validity for genetic and genomicbased in vitro diagnosticsDocument issued on April 132018
14 FoundationFocus™ CDxBRCA Technical Information Summary
15中国肿瘤驱动基分析联盟（CAGC）中国床肿瘤学会（CSCO）二代测序（NGS）技术应床肿瘤精准医学诊断识第版（试行）20160423
16中国床肿瘤学会肿瘤标志物专家委员会中国肿瘤驱动基分析联盟二代测序技术肿瘤精准医学诊断中应专家识 中华医学杂志98（26）2018710
五起草单位
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